Los termocicladores y consumibles de PCR son fuentes típicas de error en los flujos de trabajo de secuenciación de próxima generación (NGS por sus siglas en inglés). Las pesadillas van desde productos no específicos, pérdida de rendimiento hasta resultados falsos. Las ejecuciones deben repetirse con la carga del material de muestra, el tiempo y los recursos. ¿No quieres que tu PCR se convierta en un inconveniente en la NGS? ¡Entonces es conveniente echar un vistazo más de cerca a su cicladora y los consumibles!
- La PCR es fundamental en los protocolos de secuenciación de próxima generación (NGS), pero su éxito depende de termocicladores y consumibles confiables.
- Errores típicos incluyen amplificaciones no específicas, pérdida de rendimiento y problemas con placas deformadas o materiales plásticos con lixiviables.
- Un termociclador de alta calidad debe tener excelente homogeneidad de temperatura, velocidad, y ser intuitivo para maximizar la eficiencia.
- Los consumibles deben ser de calidad estándar, con paredes delgadas y sin lixiviables para evitar interferencias y asegurar la consistencia.
- El control estricto de equipos y consumibles garantiza resultados reproducibles, fiables y escalables para flujos de trabajo complejos como NGS.
El poder de la NGS
Puntuando en poder de descubrimiento, sensibilidad, escalabilidad y rendimiento, la secuenciación de próxima generación (NGS) realmente merece ser un enfoque de "próxima generación". Las ventajas son múltiples. Puede estudiar genomas completos en un solo experimento NGS e identificar nuevas variantes y transcripciones en poco tiempo. Las regiones objetivo de interés con grandes porciones de genes se pueden secuenciar simultáneamente en una enorme cantidad de muestras. Los SNP se pueden descubrir a gran escala. La capacidad de la secuenciación paralela masiva ofrece muchas oportunidades para abordar una variedad de problemas biológicos.
Fuentes de error típicas en NGS
PCR es la columna vertebral de la mayoría de los protocolos NGS. Las aplicaciones incluyen la conversión de muestras en bibliotecas de amplicones listas para la secuenciación, el enriquecimiento de muestras/bibliotecas, incluido el control de calidad y la cuantificación. La PCR se utiliza en la preparación de bibliotecas tanto para el genoma completo como para los enfoques de secuenciación dirigida. En los experimentos NGS, los procesos son complejos y costosos. El material de muestra suele ser muy valioso. Es obvio, lo que cuenta en NGS PCR: Procesamiento exitoso de muestras y resultados confiables y reproducibles basados en una gestión óptima de recursos. Por lo tanto, vale la pena evitar posibles fuentes de error.
¿Tenés en mente la confiabilidad, la calidad y el rendimiento de los termocicladores y consumibles? Si no, deberías hacerlo. Aquí viene el "por qué": ¡el ciclador de PCR y los consumibles pueden conducir a amplificaciones no específicas, pérdida de rendimiento y pueden impedir la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados!
- Efecto EDGE de los cicladores
La diferencia en el gradiente y la temperatura en la placa pueden afectar la eficiencia y dar lugar a amplificaciones no específicas. ¡Todas las plantillas deben tratarse de la misma manera!
- Lixiviables que interfieren
Los plastificantes, biocidas o agentes deslizantes pueden filtrarse del material plástico durante el uso normal en el laboratorio y pueden falsear los resultados.
- Placas deformadas
Las placas de baja calidad a menudo se deforman con los ciclos de calentamiento y enfriamiento. Esto impide la purificación manual de perlas y dificulta los flujos de trabajo de automatización sin problemas.
- Sobreimpulso o subimpulso
Las temperaturas demasiado altas (overshot) o demasiado bajas (undershoot) causadas por la inercia del bloque, después de las rampas de calentamiento o enfriamiento, tienen un efecto negativo en la PCR. El exceso al comienzo de la desnaturalización mata la actividad enzimática y la eficiencia de la polimerasa. Las posibles consecuencias son la pérdida de rendimiento hasta una amplificación no detectable. Los subbrotes al comienzo del recocido reducen la especificidad del recocido del cebador e inducen productos de amplificación no específicos.
Cómo sacar el máximo partido al PCR
Como ahora se sabe lo que es importante a la hora de adquirir PCR, resultará fácil eliminar estas fuentes de error antes de que surjan riesgos potenciales:
1. Ciclador confiable
- Excelente homogeneidad de temperatura
Los Peltiers de alta calidad garantizan diferencias de temperatura mínimas entre los pozos, lo que da como resultado una alta homogeneidad de temperatura en todo el bloque. Las temperaturas estables tratan todas sus plantillas de la misma manera: ¡la mejor prevención de efectos de borde! Puede utilizar la capacidad completa de la placa de 96 pocillos o de 384 pocillos para obtener resultados reproducibles. (Un peltier es el componente dentro de un ciclador responsable de calentar y enfriar el bloque de metal).
- Verificación rápida de temperatura
Un control de temperatura debe evaluar de manera rápida y confiable el rendimiento del ciclador, asegurando que el grado de exceso y defecto se encuentre dentro del rango óptimo. Esto permite una rápida transferencia de calor sin efectos perjudiciales.
- Velocidad del ciclador
Para mantenerse eficiente y ahorrar tiempo, el ciclador debe ser rápida y no prolongar la ejecución. Las ventajas: puede continuar el protocolo más rápido y el ciclador está disponible antes para las siguientes muestras.
La capacidad activa de calefacción y refrigeración del instrumento en combinación con la conductividad del bloque calefactor influye directamente en la velocidad. La conductividad depende nuevamente del material del que está hecho el bloque: ¡la plata es la mejor!
- Operación intuitiva
Ahorra tiempo de forma continua durante las aplicaciones de rutina.
- Redes de cicladores
Cumplí con las demandas de alto rendimiento con la ayuda de un software de gestión de termocicladores para administrar una multitud de termocicladores para una multiplicación eficiente de sus reacciones. Consumibles óptimos.
2. Consumibles óptimos
- Placas gold standard
Optá por placas de dos componentes con un marco estable de policarbonato y pocillos finos de polipropileno. ¡No economices aquí! A menudo, las placas de PCR baratas están hechas de un solo material y se deforman. Las placas de baja unión aseguran que se adhieran menos moléculas y que haya más moléculas disponibles para las reacciones químicas.
- Sin lixiviables
Asegúrese de que su fabricante de placas no utilice lixiviables en sus materiales plásticos.
- Vaso perfecto para bloquear el ajuste.
Para una transición de temperatura óptima, la forma del recipiente debe adaptarse perfectamente a la forma del bloque del ciclador.
- Paredes finas de los vasos
Para una transferencia de temperatura rápida, las paredes del recipiente deben ser lo más delgadas posible.
- Consistencia de lote a lote
Para que los datos sean comparables, elegir un fabricante confiable, para que puedas estar seguro de que siempre obtendrá la misma calidad de placa con cada nuevo pedido.
- Compatible con alto rendimiento
Las placas gold standard estables permiten la automatización. Las opciones de código de barras simplifican el trabajo con cantidades de muestra muy grandes y sistemas automatizados.
Preguntas frecuentes
Recomendamos revisar tu ciclador y consumibles - ¡no comprometas tus muestras y la confiabilidad de los resultados por PCR!
Fuente: Eppendorf - PCR for NGS - Why cyclers and consumables can spoil your run
